技術文章
Technical articles產(chǎn)品簡介:
動物或植物細胞發(fā)生氧化應激(oxidative stress) 時,會發(fā)生脂質氧化,丙二醛(Malondialdehyde, MDA)是一種生物體脂質氧化的天然產(chǎn)物,一些脂肪酸氧化后逐漸分解為一系列包括MDA在內的復雜化合物,此時通過檢測MDA的水平即可檢測脂質氧化的水平,因此MDA的測定被廣泛用作脂質氧化的指標。生物體內的一些其它生化反應也會產(chǎn)生MDA,例如thromboxane synthase 也可以催化產(chǎn)生,但只要在測定時設置適當對照即可觀察到脂質氧化水平的變化。
自備材料:
1、生理鹽水或 PBS
2、離心機、離心管或 96 孔板、光分光光度計或酶標儀、水浴鍋或恒溫箱
操作步驟(僅供參考):
1、準備樣品:
①血清、血漿、尿液、腦脊液樣品:從待測樣本中分離出的血清或血漿不應有溶血,直接檢測,如超過線性范圍,用生理鹽水或 PBS 稀釋后檢測。
②組織、細胞等樣品:組織或細胞可以使用PBS或 RAPI裂解液等進行勻漿或裂解,勻漿或裂解組織時組織重量占勻漿液或裂解液的比例應為10%;對于細胞,每106個細胞使用 0.1ml裂解液或勻漿液,勻漿或裂解后4℃ 8000~12000g 離心10min,取上清用于后續(xù)測定。勻漿或裂解等樣品制備步驟宜在冰浴或 4℃條件下進行操作,樣品準備完畢后可以用 BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度,以便于后續(xù)計算單位蛋白重量組織或細胞內MDA 含量。
③該試劑盒對于樣品中的常見化學成分的兼容性參考下表:
試劑類別 | 化學成分 | 是否干擾 |
緩沖液 | HEPES (100mM) | 否 |
Borate (50mM) | 否 | |
Phosphate (100mM) | 否 | |
Tris (25mM) | 否 | |
去垢劑 | CHAPS (≤1%) | 否 |
Triton X-100 (≤1%) | 否 | |
Tween 20 (≤1%) | 否 | |
抑制劑/螯合劑 | PMSF (≤200μM) | 否 |
EDTA (≤1mM) | 否 | |
EGTA (≤1mM) | 否 | |
Antipain (≤100μg/ml) | 否 | |
Chymostatin (≤10μg/ml) | 否 | |
Leupeptin (≤10μg/ml) | 否 | |
Trypsin (≤10μg/ml) | 否 | |
其他 | Glycerol (≤10%) | 否 |
Sucrose (250mM) | 是 |
2、配制TBA 工作液:稱取適量TBA,用TBA稀釋液配制成濃度為0.68%的TBA工作液; 例如取68mgTBA用10ml TBA 稀釋液配制,最終濃度即為0.68%的TBA工作液,TBA工作液需溶解后再使用,可以加熱到 60℃促溶,并可通過反復劇烈Vortex促溶; 配制
好的TBA工作液 4℃避光保存,至少1個月內有效。
3、稀釋系列標準品:取適量 MDA 標準品(1mmol/L),用恰當溶液稀釋至 1、2、5、10、20μM(如果進行簡易快速檢測,標準品直接稀釋10μM)。注意:待測樣品為血清、血漿時,標準品宜用生理鹽水稀釋;待測樣品由勻漿液、裂解液、PBS 獲得時,標準品宜用相同溶液稀釋,其原則是保證空白管、標準管、測定管具有可比性;配制好的 MDA標準品 4℃避光保存,至少3個月內有效。
4、配制MDA檢測工作液:臨檢測前,根據(jù)待測定的樣品數(shù)(含對照),參考下表新鮮配制適量的MDA檢測工作液。
檢測次數(shù) | 1 次 | 10 次 | 20 次 |
TBA 工作液 | 0.75ml | 7.5ml | 15ml |
抗氧化劑 | 0.031ml | 0.31ml | 0.62ml |
MDA 檢測液 | 0.075ml | 0.75ml | 1.5ml |
MDA 分離液 | 2.25ml | 22.5ml | 45ml |
總體積 | 3.106ml | 31.06ml | 62.12ml |
注意事項:
1、上述低溫試劑避免反復凍融,以免失效或效率下降。
2、參考取樣量:血清、血漿、尿液取0.1ml;低密度脂蛋白懸液取0.1~0.2ml;食用油取0.03ml;肝臟、心肌、肌肉等,取5%或10%勻漿 0.1~0.2ml。
3、測定樣品吸光度值較低時,可將水浴延長至80min,但應同時延長,以免造成批間差異。
4、待測樣本如不能及時測定,應置于-20℃保存,4天內穩(wěn)定。
5、避免使用 EDTA、枸櫞酸、氟化鈉、草酸等抗凝劑。
6、為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。
7、試劑開封后請盡快使用,以防影響后續(xù)實驗效果。
有效期:12個月有效;低溫運輸,按要求保存。